今回は最近よくやっていた実験のプロトコールを紹介します。
Fibroblast において NFκB p65 の核内移動(translocation)を Immunofluorescence Assay (IFA)で評価するプロトコール (protocol)
プロトコールの実際
1. Seed cells on glass cover slip (1×10^4 ~ 1×10^5) and incubate O/N.
(Electron Microscopy Sciences Cat: #72196-12) in 24-well plate.
2. Starve cells with FBS-free media, 1hr.
3. Stimulation cells with 50 ng/ml of TNFa for 30-40 min.
(diluted in 200µl of FBS-free media).
4. Wash twice with ice-cold PBS.
5. Fix with Cytofix/CytopermTM (BD Cat:51-2090KZ), 20min., RT.
6. 1st Ab in Perm/washTM buffer (BD Cat:51-2091KZ), 1hr, RT, shaking.
anti-p65 antibody (CST NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242), 1/500.
7. Wash with Perm/wash buffer
8. 2nd Ab in Perm/wash buffer, 30min., RT, shaking in dark.
anti-Rabbit goat antibody-Alexa fluor488 (invitrogen), 1/500.
9. Wash with Perm/wash buffer, twice
10. DAPI staining in PBS, 1min, RT.
11. Wash twice with PBS.
12. Enclose on Fisherbrand Superfrost (Cat 12-550-15)
with Fluoromount-G (SouthernBiotech Cat: 0100-01)
観察と評価
観察は蛍光顕微鏡で行う。評価については、Alexa488 で染まった p65 が核内(DAPIとマージ可能な領域)に移っている細胞数を計測する。
注意点
難しい実験ではありませんが、細胞腫によってはガラスから剥がれることがあります。また、染色と洗浄はしっかりと行わないと染めむらが生じることがあります。
関連する文献など
・原理など
・発展版としてイメージングサイトメーターを使った評価などもあります。
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